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NIM nanosystems initiative munich
Meldung

Dienstag, 20. Februar 2018

Wie genau ist mein Nanolineal?

DNA-Origami

Schema eines Nanometerlineals, das auf einem DNA-Origami Rechteck (grau) basiert. In die DNA Nanostruktur eingebrachte Farbstoffe bilden die Markierungen (rot). Die hellen Doppelpunkte auf schwarzem Hintergrund zeigen die mit Super- auflösungsmikroskopie aufgelösten Strukturen. Bild: M. Raab.

Schema eines Nanometerlineals, das auf einem DNA-Origami Rechteck (grau) basiert. In die DNA Nanostruktur eingebrachte Farbstoffe bilden die Markierungen (rot). Die hellen Doppelpunkte auf schwarzem Hintergrund zeigen die mit Super- auflösungsmikroskopie aufgelösten Strukturen. Bild: M. Raab.

Die Entwicklung und Evaluierung von DNA-Origami-basierten Nanolinealen ermöglicht immer genauere Messungen im Nanokosmos. Der NIM-Wissenschaftler Prof. Dr. Philip Tinnefeld und sein Team untersuchen solche selbst-assemblierten Nanostrukturen.


Um Längen im Alltag zu messen, benutzen wir gewöhnlich ein Lineal oder einen Gliedermaßstab („Zollstock“). Durch Vergleich der zu messenden Länge mit dem Lineal findet die Quantifizierung statt. Aber wie werden solche Abstände auf der molekularen Skala gemessen und gegen einen Standard referenziert?

In den letzten Jahren entwickelten Forscher der LMU München und der TU Braunschweig unter Leitung von Professor Öffnet externen Link in neuem FensterPhilip Tinnefeld Nanolineale, die sich dadurch auszeichnen, dass Markierungen aus leuchtenden Farbstoffmolekülen mit Abständen im Nanometerbereich entlang einer DNA Nanostruktur angebracht sind. Eine Besonderheit ist, dass diese Nanolineale in einem Selbstassemblierungsprozess mit der DNA-Origami-Technik höchst parallelisiert hergestellt werden.
DNA-Origami Nanolineale werden bereits als Referenzstrukturen für das Einstellen von Mikroskopen und als Positivkontrollen in der super-auflösenden Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt und sind die erste kommerzielle Anwendung der DNA-Origami Technik weltweit (Öffnet externen Link in neuem Fensterwww.gattaquant.com).

Aus metrologischer Sicht stellt sich die Frage, wie genau diese Nanolineale wirklich sind. Inwieweit eignen sich selbstassemblierte Nanolineale, quantitativ mikroskopische Eigenschaften zu charakterisieren und wie genau sind die Abstände auf den Nanolinealen wirklich bekannt? Auf diese und andere metrologische Fragestellungen, wie Messwerte auf die SI-Einheiten rückgeführt werden können, ist die Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB) in Braunschweig spezialisiert.
Daher schlossen sich Professor Tinnefeld (LMU) mit Wissenschaftlern der TU Braunschweig und der PTB (Fachbereich Bild- und Wellenoptik und Abteilung Fertigungsmesstechnik) zusammen und entwickelten ein Kalibrierverfahren, welches jetzt in der Fachzeitschrift Öffnet externen Link in neuem FensterScientific Reports veröffentlicht wurde.

DNA-Origami-basierte Nanolineale
Es zeigte sich, dass der mittlere Abstand zwischen den Markierungen auf den Nanolinealen mit einer Unsicherheit von 1-2 nm bestimmt werden kann. Dabei ist vor allem die Reproduzierbarkeit der Messungen an verschiedenen Tagen und an verschiedenen Mikroskopen erstaunlich. „Die Abweichung der gemessenen Abstände sind zumeist unter einem Nanometer“ konstatiert Mario Raab, Erstautor der Publikation. „Das Kalibrierverfahren ermöglicht es erstmals, unsere Nanolineale als Standards und nicht nur als Testproben zu benutzen“ fügt Raab hinzu.
„Es ist insbesondere erstaunlich, welche Genauigkeit und Reproduzierbarkeit mit diesen selbstassemblierten Strukturen möglich ist. Oftmals dienen kristalline Strukturen, bei denen die Atomlagen zählbar sind, als Normale in der Nanowelt. Mit den DNA-Origami Strukturen ist ein neuartiger Ansatz realisiert, der überall verfügbare Referenzstrukturen auf einfache und elegante Art und Weise ermöglicht.“, erklären die Partner der PTB.

Biophysikalische Messmethoden wie die Superauflösungsmikroskopie wurden in den letzten Jahren extrem vielfältig weiterentwickelt, jedoch nur bedingt standardisiert. Eine Vielzahl potentieller Anwendungen liegt im medizinischen Bereich. Wenn solche Messmethoden eines Tages zwischen krank oder gesund unterscheiden sollen, muss quantitativ sichergestellt sein, dass sie verlässlich sind. Diese Arbeit liefert ein Bespiel wie vorgegangen werden muss, um entsprechende Unsicherheiten zu bestimmen und die Risiken zu minimieren.

Nanolineale in der Expansionsmikroskopie
In der Öffnet externen Link in neuem Fensterneuesten Veröffentlichung von Dr. Max Scheible und Professor Philip Tinnefeld wird die Anwendung von DNA-Origami-basierten Nanolinealen in einer relativ neuen Mikroskopie-Technik, der Expansionsmikroskopie (ExM), gezeigt.
Bei der ExM wird die Probe physikalisch vergrößert und dadurch kann konventionelle Fluoreszenzmikroskopie eine echte Alternative zur super-auflösenden Fluoreszenzmikroskopie sein. Dazu wird die Probe in ein Polymer eigebettet und mit einem Antikörper-Fluorophor-Komplex markiert, bevor das Gel expandiert wird. Anschließend wird die Originalprobe verdaut, aber das expandierte Gel trägt die strukturellen Eigenschaften wir Form und Größe in einer 3-5-fachen Vergrößerung. Kalibriert man mit fluoreszierenden DNA-Origami-basierten Nanolinealen als Probe, so werden quantitative ExM-Messungen möglich.

Optische Spannungsmesser
In einer anderen neuen Publikation präsentieren Philip Tinnefeld und Kollegen einen Nachweis des Funktionsprinzips für einen neuen Öffnet externen Link in neuem Fensteroptischen Spannungsmesser. Dieser basiert auf einer spannungsempfindlichen DNA-Origami Struktur, markiert mit FRET Farbstoffen. Die DNA-Origami-Technik ermöglicht auch hier die nanometergenaue Positionierung der Fluoreszenzfarbstoffe.
Die Forscher konnten zeigen, dass eine Spannungszunahme zur schrittweisen Drehung und Ausrichtungsänderung der DNA Konformation führt. Diese einmalige Eigenschaft ermöglicht die Herstellung von optisch auslesbaren, dynamischen und spannungsempfindlichen molekularen Linealen. In Simulationen und Experimenten zeigen sie die erfolgreiche Anwendung von mit einem FRET Farbstoffpaar markierten DNA-Origami Strukturen, in welchen das FRET Signal entsprechend der angelegten Spannung kalibriert werden kann.

Virus-Detektion mit optischen Nanoantennen
Öffnet externen Link in neuem FensterOptische Nanoantennen zur Detektion von Zika-Virus DNA oder RNA, sowohl in Puffer als auch in Hitze-inaktiviertem menschlichen Blutserum, sind ein anderes von der Gruppe von Professor Tinnefeld entwickeltes System. Sie sind sehr sensitiv gegen kleine Variationen in der Nukleotidabfolge, und erlauben somit die Unterscheidung auch nahe verwandter Pathogene.
Die 125 nm großen optischen Antennen werden mit Hilfe von DNA-Origami aufgebaut. Sie tragen komplementäre Nukleinsäurestränge und sobald diese an die Ziel-DNA binden, gibt es ein Fluoreszenzsignal. Dieses Fluoreszenzsignal wird an der Antenne verstärkt, da assoziierte metallische Nanopartikel einen Hotspot bilden. Ziel ist die Anwendung in Einzelmolekül-basierten diagnostischen Schnelltests (Point-of-Care-Diagnostik). Die Verwendung von orthogonalen Fluoreszenzmarkern ermöglicht das sogenannte Multiplexing, die simultane Detektion verschiedener Sequenzen.

Hybridstrukturen zur Fluoreszenzverstärkung
Der Ansatz der Fluoreszenzverstärkung wurde erweitert in Öffnet externen Link in neuem FensterHybridstrukturen mit natürlichen Lichtsammelkomplexen. Durch die Bindung eines Peridinin-Chlorophyll a-Proteins, an die DNA-Origami basierte optische Antenne wurde die Lichtsammelfähigkeit um ein vielfaches erhöht. Bei der selektiven Anregung verschiedener Pigmente in diesem Lichtsammelkomplex konnte eine 500-fache Fluoreszenzverstärkung erreicht werden, hauptsächlich dadurch, dass die plasmonischen Partikel der optischen Antenne das Lichtsammeln des natürlichen Komplexes verstärken.


Die Arbeit wurde gefördert durch die Braunschweig International Graduate School of Metrology (B-IGSM), das DFG Graduiertenkolleg (Research Training Group GrK1952/1) „Metrology for Complex Nanosystems“, INAT 188/401-1 FUGG, den Excellence Cluster Nanosystems Initiative Munich (NIM) und durch die Europäische Union (Horizon 2020 grant agreement No 737089 Chipscope).


Publikation:
Using DNA origami nanorulers as traceable distance measurement standards and nanoscopic benchmark structures.
M. Raab, I. Jusuk, J. Molle, E. Buhr, B. Bodermann, D. Bergmann, H. Bosse, P. Tinnefeld. Scientific Reports 8:1780 (2018), DOI: Öffnet externen Link in neuem Fenster10.1038/s41598-018-19905-x

Quantifying Expansion Microscopy with DNA Origami Expansion Nanorulers
M.B. Scheible, P. Tinnefeld. February 14, 2018, pre-print at bioRxiv DOI: Öffnet externen Link in neuem Fenster10.1101/265405


Kontakt:
Prof. Dr. Philip Tinnefeld
Department Chemie
Physikalische Chemie
Ludwig-Maximilians-Universität München
Butenandtstraße, Haus E
D-81377 München

Tel.: +49 – (0)89 – 2180 77549

E-Mail: Philip.tinnefeld(at)cup.lmu.de

Web: tinnefeld.cup.uni-muenchen.de

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